Scheda Insegnamento: METODOLOGIE BIOCHIMICHE A.A. 2017/2018
  • Corso di Laurea: SCIENZE BIOLOGICHE (L-13)
  • Codice: 15300
  • Crediti: 6
  • Anno Off. Formativa: 2017/2018
  • Anno di Corso: 3
  • Erogazione: II semestre
  • Docente: LAURA BERTINI

Programma

a) OBIETTIVI FORMATIVI
L’insegnamento di Metodologie Biochimiche intende fornire agli studenti un quadro teorico e pratico di alcune delle principali metodiche preparative e analitiche che trovano impiego non solo nel campo della ricerca biochimica e biologico-molecolare, ma anche in altri campi tra cui quello biomedico e ambientale.
In particolare, le conoscenze impartite riguardano metodologie per l’identificazione, l’isolamento e lo studio strutturale e funzionale delle macromolecole biologiche, nonché strumenti intellettuali per l'analisi dei risultati e per la loro descrizione.
Verranno trattate sia tecniche per l’analisi di proteine e geni singoli, ma anche di interi proteomi e genomi.

b) RISULTATI DI APPRENDIMENTO ATTESI

Conoscenza e capacità di comprensione:
Al termine del corso gli studenti
- conosceranno i principi alla base delle principali tecniche impiegate nelle indagini biochimiche (centrifugazione, spettroscopia, elettroforesi, cromatografia, spettrometria, sequenzaimento proteine e acidi nucleici) ed i parametri su cui può agire per modificare una particolare indagine biochimica;
- saranno in grado di descrivere gli elementi strutturali dei principali strumenti di un laboratorio biochimico (centrifuga, spettrofotometro, spettrometro);
- conosceranno correttamente la terminologia appropriata impiegata nelle metodologie biochimiche.

Conoscenza e capacità di comprensione applicate:
Al termine del corso gli studenti
- saranno in grado di orientarsi correttamente sulla scelta delle più opportune procedure biochimiche per il raggiungimento degli obiettivi sperimentali definiti in fase di progettazione della ricerca;
- sapranno valutare il possibile impatto delle variazioni dei parametri in gioco in un esperimento biochimico e nelle principali indagini strumentali cliniche;
- sapranno svolgere praticamente gli esperimenti affrontati nella parte di laboratorio.

Autonomia di giudizio:
Gli studenti dovranno essere in grado di comprendere e discutere criticamente i risultati sperimentali ottenuti in laboratorio ed utilizzarli come base di partenza per la pianificazione degli esperimenti successivi.

Abilità comunicative:
Gli studenti dovranno avere la capacità di trasmettere le conoscenze acquisite in modo chiaro e comprensibile, anche a persone non competenti, e dovranno dimostrare l’abilità di presentare l’informazione anche con grafici e formule.

Capacità di apprendere:
Condizione di successo nell’apprendimento è considerata la capacità di leggere e comprendere un lavoro scientifico di argomento biochimico.

c) PROGRAMMA
Parte Teorica (40 ore)
Soluzioni tampone e pH. Ionizzazione di amminoacidi e proteine in funzione del pH. I principi dell’indagine biochimica. Teoria degli errori; accuratezza e precisione. (3 ore)
Spettrofotometria: leggi ed applicazioni. Legge di Lambert-Beer. Gruppi cromofori e spettri di assorbimento di proteine ed acidi nucleici. Metodi spettrofotometrici per la determinazione della concentrazione delle proteine: metodo del Biureto, di Lowry e di Bradford. Dosaggio enzimatico. Studi sull'accessibilità dei residui ionizzabili in proteine native. Fluorescenza e fosforescenza. (7 ore)
Centrifugazione. Principi base della sedimentazione. Centrifughe e loro uso. Rotori. Metodi di separazione nella centrifugazione preparativa. Centrifugazione differenziale. Centrifugazione in gradiente di densità. Ultracentrifugazione analitica. (5 ore)
Strategie per la purificazione di proteine. Estrazione cellulare, dialisi ed ultrafiltrazione. Precipitazione frazionata con sali, con solventi organici, al punto isoelettrico, al calore. (4 ore)
Metodi cromatografici: cromatografia per assorbimento, di ripartizione, a scambio ionico, per esclusione molecolare, per affinità, per interazione idrofobica, HPLC, gas cromatografia. Efficienza dei procedimenti cromatografici e scelta di un procedimento conveniente. (6 ore)
Tecniche elettroforetiche: teoria, leggi, apparati. Classificazione dei metodi elettroforetici. Elettroforesi in fase libera ed elettroforesi zonale. Elettroforesi su gel. Analisi in condizioni native e denaturanti con applicazioni per la determinazione del peso molecolare di proteine (SDS-PAGE). Western blotting. Isoelettrofocalizzazione per la determinazione del punto isoelettrico di proteine. Elettroforesi bidimensionale. Elettroforesi di acidi nucleici. Elettroforesi capillare. (5 ore)
Studi sulla struttura delle proteine. Determinazione della composizione amminoacidica, delle cisteine libere, della sequenza amminoacidica di una proteina e localizzazione dei ponti disolfuro. (4 ore)
La strumentazione e le principali applicazioni della spettrometria di massa nella moderna proteomica. (3 ore)
Caratterizzazione strutturale di acidi nucleici. Sequenziamento del DNA secondo il metodo di Sanger. Pirosequenziamento. (3 ore)

Parte pratica (8 ore)
Determinazione della concentrazione proteica di un campione incognito mediante il metodo di Bradford. Costruzione della retta di taratura sia manualmente su carta millimetrata che con il metodo dei minimi quadrati e confronto dei risultati ottenuti. Visualizzazione allo spettrofotometro dello spettro di assorbimento di una proteina con gruppi prostetici e una senza e discussione dei risultati (4 ore).
Preparazione di un gel di poliacrilammide in presenza di SDS (SDS-PAGE) e corsa elettroforetica con marcatori di peso molecolare precolorati, così da seguirne la separazione nel corso del processo elettroforetico. Illustrazione degli apparati per la realizzazione di gel di agarosio per acidi nucleici e western blotting (4 ore).

Testi consigliati

De Marco C., Cini C., Principi di metodologia biochimica. Prima ed., 2009, Piccin Nuova Libraria.
Bonaccorsi di Patti M. C., Contestabile R., Di Salvo M. L. Metodologie biochimiche. Prima ed., 2012, Casa Editrice Ambrosiana.
Stoppini M., Bellotti V., Biochimica Applicata. Prima ed., 2012, EdiSES.
Reed R., Holmes D., Weyers J., Jones A. Metodologie di base per le scienze biomolecolari. Prima ed., 2002, Zanichelli editore.
Per le attività pratiche di laboratorio vengono fornite dispense dal docente.
Le slides delle lezioni sono scaricabili all’indirizzo: https://moodle.unitus.it/moodle/course/view.php?id=627
Gli studenti non frequentanti sono incoraggiati a contattare il docente per avere informazioni sul programma, sui materiali didattici e sulle modalità di valutazione del profitto.

ENGLISH
Wilson K., Walker J. Principles and techniques of practical biochemistry. 5th ed., 2000, Cambridge University Press.
Handouts are provided by the teacher for practical laboratory activities.
Lessons slides can be downloaded at:
https://moodle.unitus.it/moodle/course/view.php?id=627
Non-attending students are encouraged to contact the teacher for information about the program, teaching materials, and the examination mode.

Propedeuticità

Per una adeguata comprensione della materia, gli studenti dovrebbero aver sostenuto gli esami di Chimica Generale, Chimica Organica, Fisica e Biochimica.

Frequenza

Facoltativa

Metodologia didattica

Ore lezione: 40

Valutazione del profitto

Prova orale

Descrizione dei metodi di accertamento

L'esame si svolge nelle forme stabilite dall'art. 23 del Regolamento Didattico di Ateneo. L'esame è orale ed è volto a valutare le capacità raggiunte dallo studente in relazione alla conoscenza e comprensione delle basi teoriche e delle applicazioni in campo biologico delle diverse metodologie preparative e analitiche trattate durante la parte teorica del corso. Nella valutazione della prova e nell'attribuzione del voto finale si terrà anche conto della capacità di analisi, di sintesi, della padronanza di espressione e della capacità di fare collegamenti fra i vari argomenti trattati. Dello svolgimento dell'esame viene redatto apposito verbale, sottoscritto dal Presidente, dai membri della commissione e dallo studente esaminato. Il voto è espresso in trentesimi, con eventuale lode. Il superamento dell'esame presuppone il conferimento di un voto non inferiore ai diciotto trentesimi e comporta l'attribuzione dei corrispondenti crediti formativi universitari.

ENGLISH
The exam is oral and aims to evaluate the students' abilities in relation to the knowledge and understanding of the theoretical bases of the various preparative and analytical methods studied during the theoretical part of the course and their biological applications. The capacity of analysis, synthesis, mastery of expression and the ability to make connections between the various topics covered will be also evaluate for the assignment of the final mark. The report of the examination is drawn up and signed by the Chairman, the members of the committee and the student examined. The mark is expressed in thirtieth, with possible praise. Passing the examination requires a minimum mark of eighteen/thirty and implies the attribution of the corresponding university education credits.

Luogo lezioni

LERGO DELL'UNIVERSITA' SNC - BLOCCO B

Orario lezioni

L'orario verrà pubblicato sil sito del corso di studi

Comunicazioni

Preferibilmente su appuntamento (mediante richiesta via e-mail).
Il docente è disponibile ad incontri di approfondimento o di chiarimento per gruppi di studenti.
Lo studio è ubicato presso il Blocco E del Campus.

Preferably by appointment (via email request).
The teacher is available for further clarification meetings with student groups.
The office is located at Building E of the Campus.