Programma

a) OBIETTIVI FORMATIVI
L’insegnamento di Tecniche Biomolecolari intende fornire agli studenti conoscenze teorico-pratiche delle principali tecniche di biologia molecolare e biochimica applicate allo studio di geni e genomi, proteine e proteomi, nonché il razionale alla base della progettazione di un esperimento e gli strumenti intellettuali per l'analisi dei risultati e per la loro descrizione.
In particolare, si intende trasferire agli studenti competenze specifiche per la manipolazione di acidi nucleici e proteine e la relativa analisi (tecniche di mutagenesi e genome editing, proteomica differenziale), per l'analisi dei livelli di espressione genica (qPCR, microarrays, trascrittomica differenziale) e della regolazione dell’espressione dei geni (studio delle modifiche epigenetiche e delle interazioni proteina-DNA), per lo studio dei pathways metabolici mediante l’analisi delle interazioni proteina-proteina. Saranno inoltre illustrati gli avanzamenti nel campo del sequenziamento di interi genomi e l’applicazione delle tecniche biomolecolari nel campo medico-diagnostico, con approfondimenti nel campo della genetica forense.

b) RISULTATI DI APPRENDIMENTO ATTESI

Conoscenza e capacità di comprensione:
Al termine del corso gli studenti
- conosceranno i principi alla base delle tecniche biomolecolari impiegate nel campo della ricerca di base e nelle indagini medico-diagnostiche;
- conosceranno i processi scientifici che hanno portato alla costante implementazione delle tecniche biomolecolari e la loro evoluzione nel tempo;
- conosceranno l’importanza della validazione statistica dei risultati di un esperimento e dei controlli che rendono un esperimento scientificamente affidabile.

Conoscenza e capacità di comprensione applicate:
Al termine del corso gli studenti
- saranno in grado di utilizzare le conoscenze acquisite per valutare ed interpretare i risultati di un esperimento, individuarne le criticità e ottimizzarlo valutando il possibile impatto delle variazioni dei parametri in gioco;
- saranno in grado di orientarsi fra le principali metodologie qualitative e quantitative, per selezionare quella più idonea allo studio del problema biologico in esame;
- sapranno svolgere praticamente gli esperimenti affrontati nella parte di laboratorio.

Autonomia di giudizio:
Gli studenti dovranno acquisire la capacità di comprendere e discutere criticamente i risultati sperimentali ottenuti in laboratorio ed utilizzarli come base di partenza per la pianificazione degli esperimenti successivi.

Abilità comunicative:
Gli studenti dovranno avere la capacità di trasmettere le conoscenze acquisite in modo chiaro e comprensibile, anche a persone non competenti, e dovranno dimostrare l’abilità di presentare l’informazione anche con schemi e formule.

Capacità di apprendere
Condizione di successo nell’apprendimento è la capacità di leggere e discutere un lavoro scientifico in autonomia e con spirito critico.

c) PROGRAMMA
Parte Teorica (32 ore)
Manipolazione acidi nucleici e proteine e relativa analisi (4 ore):
Isolamento di DNA, RNA e proteine da campioni biologici; esempi ed applicazioni. DIGE. Blotting (Western, Eastern).
Tecniche per l'analisi dell'espressione genica (6 ore):
PCR semiquantitativa, competitiva, qPCR. Microarrays a cDNA e ad oligonucleotidi; analisi dati ed applicazioni. SAGE, Differential-display, librerie sottrattive.
Analisi delle interazioni proteina-proteina (5 ore):
Tecniche di display in vitro: Protein Arrays, Far-Western, Pull-down, mRNA display e Ribosome display.
Tecniche di display in vivo: Co-Immunoprecipitazione, Tandem Affinity Purification (TAP) system, Phage Display, Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC).
Analisi delle interazioni DNA/RNA-proteina (2 ore):
Saggio di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP e ChIP-on-chip). EMSA. Southwestern. Saggio del triplo ibrido in lievito.
Metodi per lo studio delle modifiche epigenetiche (3 ore):
Tecniche basate sull’utilizzo di enzimi di restrizione sensibili alla metilazione: Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism (MSAP). Conversione con bisolfito e successivi metodi di analisi: Bisulfite (non methylation)-specific PCR e Methylation-specific PCR (MSP): Analisi delle modifiche istoniche mediante ChIP.
Tecniche di mutagenesi (2 ore):
Metodi di mutagenesi sito-specifica o casuale: mutagenesi a cassetta, mutagenesi per estensione di un primer, mutagenesi mediante PCR. Mutagenesi per ricombinazione: DNA shuffling.
Mutagenesi applicata allo studio dei promotori: mutagenesi linker-scanning.
Tecniche di genome editing (2 ore):
Zinc finger nuclease (ZFN), Transcription activator–like effector-based nuclease (TALEN) e CRISPR-Cas9 System.
Applicazioni della PCR in campo diagnostico e forense. (2 ore)
Sequenziamento del DNA. Progetto Genoma Umano. (2 ore)
Next Generation Sequencing: piattaforme per il sequenziamento di seconda e terza generazione. (4 ore)

Parte Pratica (16 ore)
Estrazione di RNA totale da tessuti vegetali, quantificazione dell’RNA e analisi su gel di agarosio (4 ore)
Sintesi del cDNA e qPCR (4 ore)
Analisi delle modifiche epigenetiche del DNA mediante Methylation Specific PCR (4 ore)
Estrazione di proteine idrosolubili da tessuti vegetali e quantificazione dell’estratto proteico mediante il metodo Bradford; purificazione in batch della proteina GST (Glutatione S-Transferasi) utilizzando biglie magnetiche coniugate a GSH (4 ore)

Testi consigliati

Brown T.A. Biotecnologie molecolari, principi e tecniche. Seconda ed., 2017, Zanichelli editore.
Watson J.D., Caudy A.A., Myers R.M., Witkowski J.A. DNA ricombinante. Seconda ed., 2008, Zanichelli editore.
Lesk A.M. Introduzione alla Genomica. Prima ed., 2009, Zanichelli editore.
Per le attività pratiche di laboratorio vengono fornite dispense dal docente.
Le slides delle lezioni sono scaricabili all’indirizzo: https://moodle.unitus.it/moodle/course/view.php?id=627
Gli studenti non frequentanti sono incoraggiati a contattare il docente per avere informazioni sul programma, sui materiali didattici e sulle modalità di valutazione del profitto.

ENGLISH
Brown T.A. Gene cloning and DNA analysis: an introduction. 7th ed., 2016, Wiley-Blackwell.
Watson J.D., Caudy A.A., Myers R.M., Witkowski J.A. Recombinant DNA, genes and genomes – a short course. 3rd ed., 2007, W.H. Freeman & Co.
Lesk A.M. Introduction to Genomics. 3rd ed., 2017, Oxford University press.
Handouts are provided by the teacher for practical laboratory activities.
Lessons slides can be downloaded at:
https://moodle.unitus.it/moodle/course/view.php?id=627
Non-attending students are encouraged to contact the teacher for information about the program, teaching materials, and the examination mode.

Propedeuticità

Essendo un corso al secondo anno della Laurea Magistrale si presuppone che gli studenti abbiano già le competenze di Biologia Molecolare e Genetica necessarie alla comprensione della materia.

Frequenza

Facoltativa

Metodologia didattica

Ore lezione: 32

Valutazione del profitto

Prova orale

Descrizione dei metodi di accertamento

L'esame si svolge nelle forme stabilite dall'art. 23 del Regolamento Didattico di Ateneo. L'esame è orale ed è volto a valutare le capacità raggiunte dallo studente in relazione alla conoscenza e comprensione delle basi teoriche e delle applicazioni in campo biologico delle diverse metodologie preparative e analitiche trattate durante le parte teorica del corso. Nella valutazione della prova e nell'attribuzione del voto finale si terrà anche conto della capacità di analisi, di sintesi, della padronanza di espressione e della capacità di fare collegamenti fra i vari argomenti trattati. Dello svolgimento dell'esame viene redatto apposito verbale, sottoscritto dal Presidente, dai membri della commissione e dallo studente esaminato. Il voto è espresso in trentesimi, con eventuale lode. Il superamento dell'esame presuppone il conferimento di un voto non inferiore ai diciotto/trentesimi e comporta l'attribuzione dei corrispondenti crediti formativi universitari.

ENGLISH
The exam is oral and aims to evaluate the students' abilities in relation to the knowledge and understanding of the theoretical bases of the various preparative and analytical methods studied during the theoretical part of the course and their biological applications. The capacity of analysis, synthesis, mastery of expression and the ability to make connections between the various topics covered will be also evaluate for the assignment of the final mark. The report of the examination is drawn up and signed by the Chairman, the members of the committee and the student examined. The mark is expressed in thirtieth, with possible praise. Passing the examination requires a minimum mark of eighteen/thirty and implies the attribution of the corresponding university education credits.

Luogo lezioni

BLOCCO B - LARGO DELL'UNIVERSITA'

Orario lezioni

L'orario è pubblicato sul sito del corso di studio alla voce "Orario delle lezioni"

Comunicazioni

Preferibilmente su appuntamento (mediante richiesta via e-mail).
Il docente è disponibile ad incontri di approfondimento o di chiarimento per gruppi di studenti.
Lo studio è ubicato presso il Blocco E del Campus.

Preferably by appointment (via email request).
The teacher is available for further clarification meetings with student groups.
The office is located at Building E of the Campus.